Патент рф 1751981

штамм микроводоросли chlorella vulgaris bin для получения биомассы и очистки сточных вод

Изобретение относится к биотехнологии. Новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN предназначен для получения биомассы и очистки сточных вод. Штамм имеет широкий спектр температуры культивирования (20-40 o С). Отсутствует сезонность в его размножении. Штамм не требователен к питательной среде и способен к высокой степени очистки различных категорий сточных вод. Штамм Chlorella vulgaris BIN проявляет более выраженные антагонистические свойства к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и инфузориям, обладает невосприимчивостью к фагам. 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2192459

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, предназначенный для получения биомассы и очистки сточных вод.

Известен термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris N для получения биомассы.

Недостатком штамма Chlorella vulgaris N является узкий температурный спектр (42 o С), приспособленность к условиям жаркого климата, например, Средней Азии и культивирование в специальных аппаратах промышленного типа (стеклотрубных установках) — (патент RU 2005777).

Известен способ биологической очистки сточных вод рыбообрабатывающих предприятий с использованием штамма Chlorella kesslerl IPPA С-112 (патент RU 2064454). Сущность способа заключается в обработке сточных вод микроводорослями Chlorella kesslerl IPPA С-112 с целью формирования альгоценоза.

Недостатком этого способа является узкий спектр очистки — только сточных вод рыбообрабатывающих предприятий — и неполная очистка от микроорганизмов.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР N С-111, обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования (а.с. SU 1751981).

Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР N С-111 является сезонность в развитии (с мая по декабрь), требовательность к составу питательной среды, стойкий цикл развития клеток, узкий спектр температуры культивирования (26-36 o С).

Целью изобретения является получение нового штамма одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, обладающего широким спектром температуры культивирования (20-40 o С), не требовательного к питательной среде и способного к высокой степени очистки различных категорий сточных вод.

Исходным для селекции Chlorella vulgaris BIN был штамм Chlorella vulgaris ИФР N С-111 из коллекции Института физиологии растений АН РФ, который культивировался на сточных водах бытовых, промышленных и сельскохозяйственных предприятий. В результате чего был отобран промежуточный штамм, наиболее приспособленный и не требовательный к условиям культивирования. Его использование показало высокую пластичность в отношении очистки различных категорий сточных вод.

Морфологические признаки. Молодые клетки шаровидной или слабоэллипсоидной формы, размером от 2 до 4 мкм. Взрослые — шаровидные, на жидкой питательной среде: аммиачная селитра 0,5 г; суперфосфат одинарный, 10% раствор 0,5 мл; суточный настой соломы 100 мл; водопроводная вода 1 л, диаметром 5-8 мкм. Окраска темно-зеленая, клетки не осаждаются, в суспензии распределены равномерно. Слабое обрастание стенок сосуда отмечается на 3-й день. На агаризированной обедненной минеральной среде: аммиачная селитра 0,5 г; суперфосфат одинарный, 10% раствор 0,5 мл; агар-агар 15 г; водопроводная вода 1 л на 10-й день на свету образуются крупные, выпуклые колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-3 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 3-7 мкм.

Физиологические признаки. Клетки делятся на 4-16, а чаще на 4-8 автоспор. Штамм автотрофный. В лабораторных условиях растет на водопроводной воде с добавлением обедненной минеральной среды на 1 л воды: аммиачная селитра 0,5 г; суперфосфат одинарный, 10% раствор 0,5 мл; суточный настой соломы 100 мл. В полупроизводственных условиях вместо соломы к 1 л обедненной минеральной среды добавляют 0,3-1,0 л сточных вод.

Не требователен к источникам азотного питания, наравне с аммиачной селитрой хорошо растет на любых азотсодержащих минеральных солях.

Штамм не требует подачи в культуру углекислого газа.

Оптимальные условия культивирования достигаются как при естественном солнечном освещении, так и при освещении культуры лампами ДРЛФ, в лотках с открытой поверхностью и толщиной слоя суспензии, не превышающей 50 см, или в стеклянных бутылях. Штамм обладает хорошо выраженными планктонными свойствами, т. е. способностью свободного парения и равномерного распределения в культуральной среде.

В процессе культивирования живые клетки практически не осаждаются. В состоянии покоя осаждение клеток начинается через 6-15 дней. Для культивирования штамма механического перемешивания суспензии не требуется.

Живые клетки штамма несут на себе отрицательный заряд, что позволяет использовать метод электрофикации для концентрирования биомассы из культурной среды.

Оптимальная температура культивирования 20-40 o С. Хорошо выносит высушивание и замораживание, переносит кратковременный перегрев до 46 o С.

Стойкого цикла развития штамма не имеется, клетки в культуре развиваются асинхронно. Режим освещения соответствует естественной солнечной инсоляции, при искусственном освещении лампами ДРЛФ в течение 20-22 ч в сутки. Достаточный минимум освещения 7-10 ч, максимум 16-22 ч. Устойчивое развитие штамма не зависит от сезона года или источника освещения.

Штамм проявляет хорошо выраженные антагонистические свойства к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и инфузориям. В течение суток лизируют грибы, дрожжи, водоросли, инфузории. Бактерии гибнут и осаждаются на дно.

Штамм строго соблюдает условия монокультуры и обладает невосприимчивостью к фагам.

Штамм отличается высокой продуктивностью (табл. 1) и способностью к очистке различных категорий сточных вод, в том числе промышленных, сельскохозяйственных и бытовых, при этом микроорганизмы полностью подавляются (табл. 2). Штамм Clorella vulgaris BIN хранится в Пензенском НИИ сельского хозяйства под 12.

Пример. В обедненную питательную среду: аммиачная селитра 0,5 г; суперфосфат одинарный, 10% раствор 0,5 мл; суточный настой соломы 100 мл; водопроводная вода 1 л вводят 0,2-0,3 л исходного штамма Chlorella vulgaris BIN с плотностью клеток 50-60 млн/мл и выращивают 3-4 суток. Полученную биомассу используют для очистки сточных вод, разведение 1:1, 1:0,5 или 1:0,2 в зависимости от категории сточных вод. Сточные воды промышленных предприятий 1: 0,2 или 1:0,3, бытовые сточные воды 1:0,5, сельскохозяйственные 1:1. Изменение химического состава воды наступает через три дня. Процент очистки в среднем составляет: промышленные сточные воды 81%, бытовые — 94%, сельскохозяйственные — 96% (табл. 2).

Таким образом, предлагаемый штамм водоросли Chlorella vulgaris BIN является более продуктивным по сравнению с известным и обладает способностью к очистке различных категорий сточных вод, в том числе промышленных, сельскохозяйственных, бытовых, причем микроорганизмы полностью подавляются.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris BIN для получения биомассы и очистки сточных вод.

Планктонный штамм chlorella kessleri, предназначенный для получения биомассы

Владельцы патента RU 2613424:

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF обладает высокой продуктивностью. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-12 и может быть использован для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных, а также как альголизант водоемов при их биологической реабилитации и очистке сточных вод. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF, предназначенный для получения биомассы.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111, предназначенный для получения биомассы, которая составляет 30 г/м 2 сухой биомассы в сутки, и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris ИФР № C-111 являются низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, предназначенный для получения биомассы и очистки сточных вод, нетребовательный к питательной среде; при производственном культивировании за одни сутки сухая биомасса составляет 60-65 г/м 2 (патент RU 2192459).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris BIN являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG, отличающийся высокой продуктивностью при производственном культивировании: 70 г/м 2 сухой биомассы за сутки (патент RU 2527895).

Недостатками планктонного штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (три дня).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототип) является штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, обладающий высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств, значительной продуктивностью и высоким содержанием ценных соединений в биомассе (патент RU 2555519). При выращивании на модельной среде (вытяжка из куриного помета), сточных водах птицефабрик и сточных водах спиртовых производств с использованием для культивирования фотобиореактора с постоянным освещением и барботированием среды атмосферным воздухом при температуре 25-27°C получена биомасса 160-180 г сухого веса/м 2 в сутки (1,6-1,8 г сухого веса/л в сутки). Недостатками прототипа являются накопление низкой биомассы культурой Chlorella vulgaris 711-54 (в 5,0-5,5 раз ниже предлагаемого изобретения), сложный состав питательной среды, а также необходимость барботирования культуры атмосферным воздухом.

Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных — основы увеличения привеса, продуктивности, эффективности рационов и повышения сохранности поголовья; как альголизант водоемов при их биологической реабилитации, а также при очистке сточных вод.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, способного активно продуцировать биомассу на среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды, использование которого предельно сокращает срок производства биомассы (см. таблицу 1).

Исходным для селекции Chlorella kessleri NF, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-12, был штамм Chlorella vulgaris BIN из коллекции Пензенского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды.

В результате селекции был отобран штамм, отличающийся высокими показателями производства биомассы за предельно минимальный срок.

Взрослые клетки — шаровидные, диаметром 8-10 мкм, при образовании автоспор 11 мкм. Хлоропласт плотно прилегает к оболочке, по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает 2/3 поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. В старых клетках хлоропласт чашевидный. Молодые клетки размером 1-3 мкм. Автоспор образуется 8-16 (редко 32), по форме тетраэдрические или эллипсоидные, после освобождения из материнской клетки часть из них свободные, другие соединены вместе в цепочку по 6-10 клеток, через некоторое время они рассыпаются на отдельные клетки. Число спор бывает только четное. На агаризированной минеральной среде на шестой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 7-8 мкм. Клетки, как молодые, так и взрослые, темно-зеленого цвета.

Штамм автотрофный, как в лабораторных, так и в производственных условиях растет на комплексной питательной среде, состоящей из растворов четырех составов химических реактивов на один литр водопроводной воды и фугата послеспиртовой барды, причем последний вводится в питательную среду до получения уровня pH не ниже 7,0.

Составы питательной среды (1):

состав №1: азотно-фосфорный — 0,30 мл;

состав №2: железисто-натриевый — 0,15 мл;

состав №3: медно-кобальтовый — 0,15 мл;

состав №4: сернокислого калия — 0,33 мл.

Штамм не требует подачи углекислого газа и барботирования культуры воздухом.

Введение фугата в суспензию хлореллы способствует образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в высокопродуктивной экосистеме аквакультуры (см. чертеж) [Богданов Н.И., Эгамов М.С., 1993 (стр. 26)].

Штамм приспособлен к прямому солнечному освещению или освещению лампами, ДНаТ- или ДРИ-250. Суточный ритм освещения как при солнечном, так и при искусственном состоит из двух фаз — световой и темновой, при этом первая составляет 20 часов, вторая 4 часа. Однако световая, как и темновая, включает два равных периода по 10 и по 2 часа. Поле каждой световой фазы на 2 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы. Спорообразование и деление клеток наступает после каждой световой фазы. За период темновой фазы в культуру выходят автоспоры. При солнечном освещении или освещении лампами температура суспензии хлореллы не должна превышать 30°C. Оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°C, в темновой фазе 23-25°C; культура выдерживает температуру до 33°C.

Цикл развития штамма за суточный период следующий: в световую фазу первого периода, который длится 10 часов, идет активный процесс фотосинтеза, в результате чего клетки интенсивно набирают биомассу. Размеры клеток увеличиваются до 8-10 мкм, клетки со спорами достигают 11 мкм. К концу первой фазы светового периода основная часть клеток со спорами или они уже поделились. В это время наступает первая фаза темнового периода, которая длится 2 часа. К концу первой фазы темнового периода в культуре преобладают молодые клетки. По окончании первой фазы темнового периода наступает вторая световая фаза, которая длится так же, как и первая — 10 часов. Активный процесс фотосинтеза продолжается, молодые клетки увеличиваются в размере до 8-10 мкм и соответственно набирают биомассу. В начале второго темнового периода биомасса становится максимальной, ее сливают и используют в виде суспензии или центрифугируют. Продуктивность штамма за сутки составляет 8-10 г/л сухого веса.

Таким образом, клеточное деление, формирование и освобождение автоспор происходит два раза в течение суток и имеет строгую привязку к определенному времени.

Штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще, а также равномерно распределятся в культуральной среде благодаря тому, что клетки несут на себе отрицательный заряд.

Данная культура не реагирует на сезонность, отмечается высокая бактерицидность к патогенной микрофлоре (Протокол испытаний №16587, прилагается), агглютинация отсутствует, автолиз клеток не наблюдается.

Штамм строго соблюдает условия монокультуры по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.

Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают, например, при длительных перевозках в неприспособленных емкостях, а также при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами. При культивировании штамм требователен к строгому соблюдению биотехнологии выращивания, составу питательной среды и фугату послеспиртовой барды, при этом к использованию допускается зерновой (пшеница, кукуруза, ячмень) фугат.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования

Для культивирования штамма используется «Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2571939), которая позволяет использовать как светильники, так и солнечное освещение. Установка содержит расположенные на каркасе два аквариума для суспензии, светильники, емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии, соединенные с аквариумами трубопроводами. Аквариумы соединены между собой трубопроводом для уравновешивания объема в каждом аквариуме. Один из аквариумов для суспензии выполнен с возможностью выращивания маточной культуры и обеспечивает единый биотехнологический процесс. Светильники в каждом аквариуме расположены эксцентрично по отношению к его продольной оси. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за один день получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.

Культивирование планктонного штамма Chlorella kessleri NF с использованием фугата послеспиртовой барды в составе питательной среды способствует интенсивному набору биомассы, во много раз превышающей известные штаммы (табл.), причем без подачи углекислого газа, барботирования воздухом, а также исключая постоянное перемешивание суспензии.

Пример получения биомассы

В аквариумы «Установки непрерывного выращивания планктонных водорослей» по патенту 2571939 вводят питательную среду (1) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella kessleri NF с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°C. По истечении этого периода лампы отключают на 2 часа. По окончании 2 часов повторно включают лампы на 10 часов. По окончании второго светового периода культуру сливают и используют для выпаивания животным или центрифугируют для получения биомассы. За суточный период культивирования биомасса составляет 10 г/л сухого веса.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена биомасса с использованием планктонного штамма Chlorella kessleri NF на питательной среде (1) с добавлением фугата послеспиртовой барды в модельной установке по патенту 2571939, которая за одни сутки составила 8-10 г/л сухого веса, что превышает показатель прототипа в 5,5 раза.

Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным по сравнению с известными и имеет широкий спектр использования биомассы: как корм для сельскохозяйственных животных; как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод.

1. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris — продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.

2. Патент РФ 2192459 от 18.04.2001, кл. 7 c12N 1/12, C02F 3/34. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris BIN для получения биомассы и очистки сточных вод. Богданов Н.И. 10.11.2002. Бюл. №31.

3. Патент РФ 2527895 от 30.03.2010, кл. C2. Планктонный штамм водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий. Богданов Н. 10.09.2014. Бюл. №25.

4. Патент РФ 2555519 от 12.08.2013, кл. C2. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств. Лобакова Е.С. и др. 10.07.2015.

5. Патент РФ 2571939 от 15.04.2015. кл. C1. Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей. Богданов Н.И. 27.12.2015. Бюл. №36.

6. Богданов Н.И., Эгамов М.С. Микробиологические процессы и рыбоводные результаты интенсивно эксплуатируемых прудов Таджикистана. Деп. ВИНИТИ №197 — B93, 1993. — С. 80.

Планктонный штамм Chlorella kessleri ВКПМ А1-12, предназначенный для получения биомассы.

планктонный штамм chlorella kessleri для предотвращения «цветения» водоёмов синезелеными водорослями

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri ARW депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-11 и может быть использован для предотвращения «цветения» водоемов синезелеными водорослями. Изобретение позволяет предотвращать «цветение» водоемов синезелеными водорослями. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri ВКПМ AI-11 ARW, предназначенный для предотвращения «цветения» водоемов синезелеными водорослями (цианобактериями).

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № С-111, обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 является сезонность в развитии, требовательность к составу питательной среды, стойкий цикл развития клеток, узкий спектр температуры культивирования (26-36°С).

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, обладающий широким спектром температуры культивирования (20-40°С), не требовательный к питательной среде и способный к высокой степени очистки различных категорий сточных вод (патент RU 2192459), использующийся также для биологической реабилитации водоемов (Богданов, 2008).

Недостатком штамма Chlorella vulgaris BIN является отсутствие сезонности размножения в условиях естественных водоемов, что затрудняет его использование на водоемах различных климатических зон. Слабовыраженное сохранение жизнеспособности в водоемах при температуре воды от 0 до 16°С требует проведения кроме основной, многократных дополнительных альголизаций. Недостаточная приспособляемость к естественным условиям водоема требует дополнительной его адаптации. Необходимым условием для использования штамма Chlorella vulgaris BIN является наличие в водоеме растительноядных рыб (белый и пестрый толстолобики) в количестве 1-3 экз./га. Основным недостатком штамма Chlorella vulgaris BIN является узкий спектр приспособленности — только к сточным водам.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG, обладающий сезонностью размножения в условиях естественных водоемов, отличающийся высокой продуктивностью при производственном культивировании, имеющий возможность к жизнеспособности в водоемах от 0 до 16°С, наделенный адаптацией к условиям различных климатических зон, обладает способностью подавления синезеленых водорослей (патент CZ 301670).

Недостатком штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG является отсутствие способности предотвращения «цветения» водоемов синезелеными водорослями. Для подавления синезеленых водорослей необходимо эквивалентное количество суспензии хлореллы, что легко достижимо в лабораторных условиях, но осуществление проблематично для водоемов.

Целью изобретения является получение нового штамма одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri ВКПМ Al-11 ARW, обладающего способностью предотвращать «цветение» водоемов синезелеными водорослями, расти в производственных культиваторах при температуре 25-30°С, а в водоемах сохраняться от 4 до 16°С и расти от 17 до 30°С, отличающийся более высокой продуктивностью при культивировании в производственных установках, имеющего возможность сезонного размножения в условиях естественных водоемов и круглогодичного развития в производственных культиваторах, наделенного адаптацией к условиям водоемов различных климатических зон и к воде различных регионов для производственного культивирования.

Исходным для селекции Chlorella kessleri ВКПМ Al-11 ARW был штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG из коллекции водорослей Карлова университета в Праге (CAUP) с обозначением CAUP H 8701, который культивировался на водах естественных и искусственных водоемов различных климатических зон. В результате был отобран промежуточный штамм, наиболее приспособленный к естественным условиям водоемов. Его использование показало высокую пластичность в отношении культивирования как в водоемах, так и в производственных культиваторах. В водоемах показал способность предотвращать «цветение» воды синезелеными водорослями, относящимися к трем родам Aphanizomenon, Anabaena, Microcystis, виды которых в водоемах чаще всего вызывают массовое развитие.

Морфологические признаки. Молодые клетки слабоэллипсоидной формы, размером 2-3 мкм. Взрослые клетки шаровидные, 8-10 мкм в диаметре. Клетки с уже сформированными автоспорами, но еще находящиеся в материнской оболочке 8-12 мкм в диаметре. Размер клеток, готовых к делению, зависит от количества автоспор в них. Молодые клетки наделены тонкой клеточной оболочкой, в процессе роста оболочка утолщается. Оболочка бесцветная, на просвет прозрачная. Автоспоры освобождаются из клетки путем разрыва оболочки обычно на 2-3 доли, которые связаны между собой. Хлоропласт плотно прилегает к оболочке, по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает 2/3 поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. Размножение происходит автоспорами. Споры одинакового размера. Число спор четыре. Иногда может быть две или больше четырех (восемь), но только четное количество. Деление клеток — асинхронное. Клетки, как молодые, так и взрослые -темно-зеленого цвета.

Физиологические признаки. Штамм автотрофный. Как в лабораторных, так и в производственных условиях растет на питательной среде, состоящей из растворов:

на один литр водопроводной воды. Для приготовления раствора углекислого газа используется зерноматериал. Раствор углекислого газа в количестве 2-10 мл/л вводится в культуральную среду ежедневно. Штамм хорошо развивается как при естественном, так и при искусственном освещении, при этом также используется комбинированное освещение — солнечным светом и лампами. При солнечном освещении или освещении лампами температура суспензии хлореллы не должна превышать 30°С. Оптимальная температура культивирования в дневное время 28-30°С, в ночное 23-25°С.

Штамм приспособлен к прямому солнечному освещению или освещению лампами ДРИ — и ДНаТ-250. Режим освещения как при солнечном, так и лампами составляет 10-12 часов. Штамм устойчиво развивается как при естественном, так и искусственном освещении и не зависит от сезона года.

Антагонистические свойства штамма проявляются при наборе культурой оптической плотности 0,85 D (440), при этом наступает лизис прочей альго-флоры, гибель бактерий, грибов и дрожжей. Штамм обладает устойчивостью к фагам.

Стойкого цикла развития у штамма нет. Деление клеток происходит в любое время суток. Штамм строго соблюдает условия монокультуры.

Культуральные свойства. Для культивирования штамма используется установка для выращивания планктонных водорослей (патент RU 2485174), которая позволяет использовать светильники или солнечное освещение. Емкости установки выполнены в виде прямоугольного параллелепипеда из прозрачного стекла с одним отверстием на нижней плоскости для слива готовой суспензии и тремя отверстиями на верхней плоскости для размещения датчиков внутри аквариума, трубопроводов для подачи питательной среды и санитарного обслуживания. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за три дня вместо четырех получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440) (таблица).

Штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще, а также равномерно распределятся в культуральной среде.

Живые клетки штамма заряжены отрицательно, что позволяет им находиться друг от друга на равноудаленном расстоянии. Потеря заряда приводит к гибели клетки, и в этом случае она осаждается на дно емкости культиватора.

Штамм отличается высокой приспособляемостью к различным категориям водоемов, а также развивается в водоемах различных географических зон, предотвращая цветение воды в этих водоемах.

Штамм выращивается на жидкой питательной среде с использованием водопроводной воды. В состоянии покоя для естественного осаждения клеток требуется 2-3 недели. Осевшие клетки можно вывести из покоя путем удаления надосадочной жидкости, добавления питательной среды и в течение суток выдержав на рассеянном свету.

Клетки в культуре погибают при динамических ударах, например, длительная перевозка в цистернах, а также при механическом перемешивании культуры. При культивировании в установках штамм требователен к соблюдению биотехнологии выращивания, составу питательной среды и подаче раствора углекислого газа. В естественных условиях легко приспосабливается к условиям водоема, в который он вводится.

Штамм относится к категории пресноводных, однако выносит соленость воды до 20%. Для культивирования штамма не требуется создания условий стерильности. Культивирование ведется как в помещении, так и под открытым небом.

В естественных условиях водоемов штамм предотвращает «цветение» воды синезелеными водорослями.

Срок сохранения жизнеспособности клеток в культуре не менее 10 лет при условии хранения на рассеянном свету при комнатной температуре. В естественной среде водоема он может развиваться неопределенно долго, пока не создадутся условия, не совместимые с жизнедеятельностью растительных организмов, например выброс в водоем агрессивных химических соединений техногенного или естественного характера.

Пример 1. Штамм культивируют в установке для выращивания планктонных водорослей. Исходная оптическая плотность культуры составляет 0,35-0,50 D (440). За три дня культура достигает нормативной оптической плотности 1,8-2,0 D (440). В таком виде культуру используют для альголизации водоема.

Пример 2. Для проведения альголизации с целью предотвращения «цветения» синезелеными водорослями по площади водоема рассчитывают количество необходимой суспензии хлореллы. При этом на 30-50 км 2 площади водоема расход суспензии хлореллы оптической плотности 1,8-2,0 D (440) составляет 50-60 литров. На водоем площадью 110 км 2 расходуется 120-140 литров суспензии хлореллы. Необходимое количество суспензии хлореллы вводится под лед в зимний период в средней части водохранилища в двух точках. Весной в приплотинной части водоема отбирают пробы воды и в них устанавливают наличие клеток хлореллы штамма Chlorella vulgaris ARW. В течение летнего и осеннего периода следят за состоянием водоема. Отсутствие «цветения» воды синезелеными водорослями свидетельствует о том, что благодаря альголизации водоема штаммом Chlorella kessleri ВКПМ AI-11 ARW предотвращается «цветение» воды синезелеными водорослями.

Таким образом, предлагаемый штамм водоросли Chlorella kessleri ВКПМ Al-11 ARW является более продуктивным по сравнению с известными и обладает способностью предотвращать «цветение» водоемов синезелеными водорослями.

1. Н.И. Богданов. Биологическая реабилитация водоемов. Пенза, РИО ПГСХА, 2008. — 151 с.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм микроводоросли Chlorella kessleri ВКПМ Al-11 для предотвращения «цветения» водоемов синезелеными водорослями.

Планктонный штамм chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы

Владельцы патента RU 2644653:

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris GKO, обладающий тонкой оболочкой, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-24. Штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24 может быть использован для получения пищевой биомассы, предназначенной для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка. Изобретение позволяет сократить срок культивирования биомассы одноклеточной водоросли. 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы.

Известен типовой штамм 132-1 Chlorella vulgaris f. suboblonga. Клетки эллипсоидные, 2,8-6,1 мкм длиной и 1,7-5,5 мкм шириной, при образовании автоспор 8,0 и 5,5 мкм соответственно. Оболочка тонкая. Хлоропласт широкий поясковидный незамкнутый или корытовидный. Положение хлоропласта может быть ориентировано по отношению к длинной оси клетки продольно или поперечно. Автоспоры по 2-4, реже по 8, сразу после освобождения неправильно эллипсоидные. Типовой штамм 132-1 хранится в Ботаническом институте РАН и является музейным образцом [Андреева В.М., 1975 (стр. 41)].

Известен штамм (прототип) одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР №С-111, предназначенный для получения биомассы и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981). Клеточная оболочка состоит из внутреннего и внешнего слоев, причем внешний слой содержит обширный миофибриллярный материал (Skaloud P. et al. 2014).

Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР №С-111 является стойкий асинхронный цикл развития клеток, прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка, а также длительный срок культивирования, который составляет четверо суток.

Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения пищевой биомассы, использующейся как продукт питания в виде напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, обладающего тонкой оболочкой и способного активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, полученного с использованием зерноматериала (голозерного овса), сокращение срока культивирования до одних суток, за которые хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440).

Исходным для селекции Chlorella vulgaris GKO, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-24, был штамм Chlorella vulgaris ИФР №С-111 из коллекции Института физиологии растений РАН, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав зерноматериала (голозерного овса) для получения раствора углекислого газа. Для достижения синхронной культуры использовалась автоматическая установка (патент RU 2540011).

В результате селекции был отобран штамм, наделенный тонкой оболочкой, способный интенсивно воспроизводить биомассу в синхронном режиме культивирования и поддерживать монокультуру в процессе производства.

Морфологические признаки. Клетки эллипсоидные, особенно молодые, 2,5 мкм длиной и 1,6 мкм шириной, взрослые клетки 5,4 мкм длиной и 4,2 мкм шириной, при образовании автоспор до 7,0 мкм длиной и 5,2 мкм шириной. Оболочка клеток тонкая. Хлоропласт корытовидный, положение его по отношению к длинной оси клетки может быть продольным или поперечным. При поперечном расположении хлоропласта он имеет вид незамкнутого пояска, при этом оба конца клетки остаются свободными, может выстилать только один конец клетки. Пиреноид широкоэллипсоидный, крахмальная обертка состоит из двух полусферических скорлупок. Обычно ядро в живых клетках не видно. Автоспор по 2 и реже по 4, сразу после освобождения имеют эллипсоидную форму. Число спор только четное. Пустая оболочка материнской клетки имеет один разрыв. На агаризированной минеральной среде на седьмой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 4,8 мкм длиной и 4,0 мкм шириной. Цвет клеток как молодых, так и взрослых темно-зеленый.

Физиологические признаки. Штамм автотрофный, в лабораторных условиях растет на модифицированной минеральной питательной среде, в состав которой входит раствор углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса. Состав питательной среды (1) следующий:

1. Аммиачная селитра, ГОСТ 2-2013 — 0,18 г.

2. Аммофос, ГОСТ 18918-85, 15% раствор — 0,09 мл.

3. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор — 0,33 мл.

4. Железо хлорид, ГОСТ 4147-74, 1% раствор — 0,15 мл.

5. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор — 0,5 мл.

6. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор — 0,5 мл.

7. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) — 2,0-5,0 мл.

8. Водопроводная вода по СанПиН 2.1.4.1074-01 — 1000 мл.

В производственных условиях используется рабочая питательная среда, в которую входят растворы четырех составов химических реактивов и раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе. Состав рабочей питательной среды (2) на один литр водопроводной воды по СанПиН 2.1.4.1074-01 следующий:

1. Азотно-фосфорный — 0,25 мл.

2. Железисто-натриевый — 0,15 мл.

3. Медно-кобальтовый — 0,15 мл.

4. Сернокислого калия — 0,30 мл.

5. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) — 2,0-5,0 мл.

Штамм не требует постоянного перемешивания, подачи баллонного углекислого газа и барботирования культуры воздухом.

Использование для культивирования хлореллы раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе, способствует поддержке в суспензии СО₂ в процессе роста водорослей и образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в экосистеме аквакультуры (Богданов Н.И., 1986).

Освещение культуры штамма производится лампами ДНаТ- или ДРИ-250. Учитывая, что можно использовать как солнечное, так и искусственное освещение, суточный ритм состоит из двух фаз, которые относятся к световой и темновой с различными периодами освещения. Первая фаза составляет 20 часов, вторая — 4 часа, при этом световая включает два равных периода по 10 часов. После первого светового периода (этапа фотосинтеза) на 4 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы — этапа образования спор и выхода их из материнской клетки. Учитывая, что культура работает в синхронном режиме, ей для спорообразования и деления клеток необходимо не менее 4 часов. За период темновой фазы автоспоры освобождаются и выходят из клеток в культуру, где они готовы к дальнейшему росту. Далее светильники включаются на 10 часов для исполнения второго периода световой фазы. Таким образом, в течение суток хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность клеток.

Как при солнечном, так и при искусственном освещении оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°С, как снижение температуры ниже 28°С, так и повышение выше 30°С приводит к задержке роста клеток в культуре. В темновой фазе температура может снижаться до 23-25°С.

Культуральные свойства. Штамм относится к планктонным, и клетки обладают свойствами, присущими этим водорослям, т.е. они находятся во взвешенном состоянии и свободно парят в водной толще, им свойственно равномерное распределение в культуральной среде, чему способствует наличие отрицательного заряда клеток.

Штамм культивируется круглый год, сезонных изменений не отмечается, в процессе выращивания подавляет патогенную микрофлору, дрожжи, грибы и вирусы, агглютинация не происходит, автолиз клеток не наблюдается, алкалоиды отсутствуют.

Штамм выращивается в условиях монокультуры, он строго соблюдает эти условия по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования. Для культивирования штамма используется «Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2540011), которая позволяет использовать как искусственное, так и солнечное освещение. Установка содержит систему биореакторов хлореллы, реактор раствора углекислого газа, станцию подготовки питательного раствора, светильники в виде электроламп, снабженные системой охлаждения. Устройства заполнения, регулирования, мойки и дренажа размещены и подключены под системой секций биореактров. Емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии соединены с аквариумами трубопроводами. Установка позволяет обеспечить процесс производства суспензии хлореллы в автоматическом режиме. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за одни сутки получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением требований санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.

Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами, а также при барботировании культуры воздухом или углекислым газом. В установке, где культивируется хлорелла, не допускается соприкосновение суспензии с металлическими предметами, трубопроводы в установке должны иметь пищевую сертификацию. Культивирование штамма выполняется при строгом соблюдении биотехнологии выращивания хлореллы.

Культивирование планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с использованием раствора углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса, способствует получению пищевой биомассы и исключает постоянное перемешивание суспензии, причем без подачи баллонного углекислого газа и барботирования ее воздухом.

Пример получения пищевой биомассы

В емкости аквариумов установки (патент RU 2540011) вводят рабочую питательную среду (2) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°С. По истечении этого периода лампы отключают на 4 часа. По окончании 4 часов повторно включают лампы на 10 часов.

По окончании второго светового периода культуру сливают и используют как пищевую биомассу для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка. За суточный период культивирования биомасса составляет 1,0 г/л сухого веса.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена пищевая биомасса в автоматической установке (патент RU 2540011) с использованием планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO в процессе синхронного культивирования на рабочей питательной среде (2), которая за одни сутки достигла нормативного показателя по оптической плотности 1,8-2,0 D (440).

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO успешно прошел этап лабораторного, экспериментального, полупромышленного, промышленного культивирования и используется для приготовления пищевых продуктов.

Таким образом, получен новый планктонный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO, обладающий тонкой оболочкой, способный активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, приготовленного с использованием зерноматериала (голозерного овса), и предназначенный для получения пищевой биомассы, которая может быть использована для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.

1. Андреева В.М. Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. Л.: «Наука», Ленингр. отд., 1975. — 110 с.

2. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris — продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.

3. Skaloud P., Nemcova Y., Pytela J., Bogdanov N.I., Bock С, Pickinpaugn S.H. Planktochlorella nurekis gen. et. sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga carrying significant biotechnological potential. Fottea, Olomouc, 14 (1): 53-62, 2014.

4. Патент РФ 2540011 от 10 декабря 2013, кл. С12М 1/00. Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей. Грабарник В.Е., Карелин Н.В. 27.01.2015.

5. Богданов Н. И. Культивирование хлореллы и ее продуктивность в Таджикистане. Доклады АН Таджикской ССР. Том XXIX, №6. Душанбе, 1986. — С. 370-372.

Планктонный штамм Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24, предназначенный для получения пищевой биомассы.